تحقیق بررسی اثر مهار واریانت Oct4B1 بر پروفایل بیانی ژن های کنترل کننده

تحقیق بررسی اثر مهار واریانت Oct4B1 بر پروفایل بیانی ژن های کنترل کننده مسیرهای سلولی مرگ برنامه ریزی شده

دانلود تحقیق بررسی اثر مهار واریانت Oct4B1 بر پروفایل بیانی ژن های کنترل کننده مسیرهای سلولی مرگ برنامه ریزی شده

در قالب Word و در ۱۱۶ صفحه، قابل ویرایش، شامل:

فصل اول: کلیات و مروری  بر مطالعات گذشته

فصل اول: کلیات و مروری  بر مطالعات گذشته

1-1- تاریخچه

2-1- سلول‌های بنیادی

3-1- سلول بنیادی سرطان (Cancer Stem Cell)

4-1- مکانیسم‌های مولکولی خود بازآفرینی در سلول‌های بنیادی

5-1- ژن OCT4

6-1- مسیر مرگ برنامه ریزی شده (Apoptosis Pathways)

7-1- استرس(Stress)

8-1- طراحی تحقیق و اهمیت آن

فصل دوم: مواد و روش‌ها

1-2- تهیه رده‌های سلولی

2-2- استخراج RNA تام سلولی

3-2- بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده

1-3-2- بررسی جذب نوری با دستگاه اسپکتروفتومتر

2-3-2- الکتروفورز در ژل آگارز

1-2-3-2- روش تهیه محلول‌ها و بافرهای مورد نیاز در الکتروفورز

1-1-2-3-2- محلول EDTA (pH=۸ و۰٫۵M)

2-1-2-3-2- تهیه بافر TBE ۵X

2-2-3-2- عکس‌برداری از ژل آگارز

4-2- واکنش رونویسی معکوس

5-2- واکنش PCR

1-5-2- طراحی پرایمرها

1-1-5-2- آماده‌سازی پرایمرها

2-5-2- واکنش PCR

3-5-2- واکنش Real-Time

1-3-5-2- انجام واکنش Real-Time PCR

2-3-5-2- تعیین Efficiency هر جفت پرایمر

6-2- سرکوب بیان ژن از طریق استراتژی siRNA

1-6-2- طراحی الیگو نوکلئوتیدهای siRNA

2-6-2- آماده‌سازی سلول‌ها جهت انجام ترانسفکشن siRNAها

3-6-2- تهیه سوسپانسیون و انجام  ترانسفکشن siRNAها

7-2- بررسی میزان زنده ماندن سلول‌ها پس از ترانسفکشن با انجام تست MTT

1-7-2- روش تهیه محلول رنگ MTT

1-1-7-2- آماده‌سازی سلول‌ها و انجام تست MTT

2-7-2- آنالیز میزان جذب نوری در طول موج ۵۷۰ نانومتر با کمک دستگاه اسپکتروفتومت

8-2- بررسی میزان رخداد آپوپتوزیس با روش Annexin-V FLOUS

1-8-2- آماده‌سازی محلول‌های رنگ کیت

9-2- تعیین پروفایل بیانی ژن‌های کنترل‌کننده مسیر آپوپتوزیس

10-2- تعیین پروفایل بیانی ژن‌های کنترل‌کننده مسیر استرس

فصل سوم: نتایج و یافته‌ها

1-3- توصیف رده‌های سلولی

2-3- تعیین کمیت و کیفیت RNA استخراج شده

3-3- بهینه‌سازی شرایط واکنش Real-Time qPCR

4-3- تعیین پروفایل بیانی واریانت های OCT۴

1-4-3- پروفایل بیانی واریانت های OCT۴ در رده‌های سلولی مورد مطالعه

5-3- تأیید مهار واریانت OCT۴B۱ در سلول‌های گروه آزمایش

6-3- تأثیر مهار واریانت OCT۴B۱ بر میزان زنده ماندن سلول‌ها (viability)

7-3- مهار OCT۴B۱ باعث افزایش میزان آپوپتوزیس می‌شود

8-3- PCR Array

1-8-3- انجام PCR Array و آنالیز نتایج

2-8-3- ژن‌های مورد بررسی در مسیر سلولی مرگ برنامه‌ریزی‌شده

1-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های TNF Ligand Family

2-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های TNF Receptor Family

3-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های Bcl-۲ Family

4-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های Caspase Family

5-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های IAP Family

6-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های TRAF Family

7-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های CARD Family

8-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های Death Domain Family

9-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های Death Effector Domain Family

10-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های CIDE Domain Family

11-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های p۵۳ and DNA Damage Response

12-3-8-3- پروفایل بیانی ژن‌های Anti-Apoptosis

9-3- ژن‌های مورد بررسی در مسیر سلولی استرس (پروتئین‌های شوک حرارتی و چاپرون ها)

1-9-3- الگوی بیانی ژن‌های مسیر استرس (پروتئین‌های شوک حرارتی و چاپرون ها)

1-1-9-3- پروفایل بیانی ژن‌های  HSP۹۰ Family Members

2-1-9-3- پروفایل بیانی ژن‌های  HSP۷۰ Family Members

3-1-9-3- پروفایل بیانی ژن‌های  HSP۴۰ Family Members

4-1-9-3- مقایسه پروفایل بیانی ژن‌های  HSP۶۰ Family Members

5-1-9-3- پروفایل بیانی ژن‌های  Small HSPs

6-1-9-3- پروفایل بیانی ژن‌های  Other Regulators of Protein Folding

فصل چهارم: بحث، نتیجه‌گیری و پیشنهادها

1-4- اهمیت تحقیق و اهداف آن

2-4- بررسی بیان واریانت‌های OCT۴ در رده‌های سلول سرطانی مورد مطالعه

3-4- نقش OCT۴B۱ در دو مسیر مهم سلولی آپوپتوزیس و استرس سلولی

4-4- ارتباط مهار واریانت OCT۴B۱ با میزان زنده ماندن (viability) سلول‌ها

5-4- مهار OCT۴B۱ باعث افزایش میزان آپوپتوزیس می‌شود

6-4- بررسی پروفایل بیانی ژن‌های کنترل‌کننده مسیر آپوپتوزیس به دنبال سرکوب بیان واریانت OCT۴B۱ در رده‌های سلول سرطانی مورد مطالعه

7-4- بررسی پروفایل بیانی ژن‌های مؤثر در مسیر استرس به دنبال سرکوب بیان واریانت OCT۴B۱ در رده‌های سلول سرطانی مورد مطالعه

8-4 نتیجه‌گیری نهایی

9-4 پیشنهادات

10-4- پیوست‌ها

فهرست منابع و مأخذ

چکیده انگلیسی

فهرست شکل‌ها:

شکل 1-2- جایگاه پرایمرها روی توالی‌های واریانت های OCT۴

شکل 2-2- منحنی استاندارد مورد استفاده در تعیین Efficiency واکنش

شکل 2-3- تصویر شماتیک یک پلیت PCR Array

شکل 3-1- تصویر الکتروفورز نمونه Total RNA استخراج شده از سه رده سلولی مورد مطالعه

شکل 3-2- میزان بیان واریانت های OCT۴ در رده‌های سلول سرطانی مورد مطالعه. محور افقی: سه رده سلول سرطانی شامل AGS (آدنوکارسینوم معده)، ۵۶۳۷ (تومور مثانه) و U۸۷MG (تومور بدخیم مغز). محور عمودی: میزان بیان هر واریانت (َA:OCT۴A ، B: OCT۴B و B۱: OCT۴B۱) نسبت به ژن بتا اکتین (ژن خانگی به‌عنوان کنترل داخلی). تصویر به خوبی نشان می‌دهد که هر سه واریانت A، B و B۱ در رده‌های سلولی به کار رفته بیان می‌شوند.

شکل 3-3- میزان بیان واریانت OCT۴B۱ در رده سلولی AGS، ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت پس از ترانسفکشن siRNA. محور افقی: دو گروه تست (ترانسفکت شده با OCT۴B۱ siRNA) و گروه کنترل (ترانسفکت شده با scramble siRNA) رده سلولی  AGS(آدنوکارسینوم معده). محور عمودی: میزان بیان واریانت OCT۴B۱ در مقایسه با بتا اکتین (ژن خانگی به‌عنوان کنترل داخلی) پس از گذشت ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت از ترانسفکشن سلولی

شکل 3-4- نتایج تست MTT در رده سلولی AGS. نتایج نشان می‌دهد میزان زنده ماندن سلول‌های ترانسفکت شده با OCT۴B۱-siRNA در مقایسه با سلول‌های ترانسفکت شده با scramble siRNA کمتر است و این کاهش زنده ماندن با گذشت زمان بیشتر می‌شود.

شکل 3-5- نتایج تست فلوسایتومتری میزان رخداد اپوپتوزیس در رده سلولی  AGS، ۴۸ ساعت پس از ترانسفکشن. Test (سلول‌های ترانسفکت شده با OCT۴B۱ siRNA)، Control (سلول‌های ترانسفکت شده با scramble siRNA). سلول‌های قرار گرفته در مربع پایین سمت راست، نشان‌دهنده سلول‌های اپوپتوتیک می‌باشند. از کیت Annexin-V-FLOUS جهت تعیین درصد سلول‌های آپوپتوتیک استاده شده است.رنگ آنکسین (Annexin-V-FLOUS)، متصل به FITC است که توسط شناساگر FL۱ ردیابی می‌شود و رنگ پروپیدیوم آیودید (PI) توسط شناساگر FL۳ شناسایی می‌شود.

شکل 3-6- نمونه‌ای از نتایج منحنی واکنش (سمت چپ) و منحنی ذوب (سمت راست) تست PCR Array

شکل 3-7- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده TNF ligands، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-8- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده TNF receptors، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-9- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده BCL۲ (۱)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-10- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده BCL۲ (۲)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱.

شکل 3-11- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده Caspase، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-12- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده IAP، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-13- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده TRAF، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-14- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده CARD، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-15- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده Dath Domain، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-16- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده Dath Effector، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-17- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده CIDE، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-18- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده P۵۳ and DNA damage (۱)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-19- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده P۵۳ and DNA damage (۲)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-20- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده Anti-apoptosis (۱)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-21- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده Anti-apoptosis (۲)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-22- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده HSP۹۰، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-23- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده HSP۷۰، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-24- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده HSP۴۰ (۱)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-25- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده HSP۴۰ (۲)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-26- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده HSP۴۰ (۳)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-27- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده HSP۴۰ (۴)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-28- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده HSP۶۰، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-29- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده Small HSPs، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-30- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده Other protein folding (۱)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

شکل 3-31- نمودار تغییرات بیان ژنی خانواده Other protein folding (۲)، در سه رده سلولی AGS، ۵۶۳۷ و U۸۷MG، پس از مهار واریانت OCT۴B۱

فهرست جداول

جدول 2-1- توالی و مشخصات پرایمرها

جدول 3-1- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده TNF ligands به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-2- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده TNF receptor به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-3- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده BCL۲ به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-4- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده Caspase به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-5- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده IAP به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-6- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده TRAF به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-7- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده CARD به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-8- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده Death Domain به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-9- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده Death Effector به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-10- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده CIDE به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-11- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده p۵۳ and DNA Damage Response به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-12- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده Anti-Apoptosis به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-13- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده HSP۹۰ Family Members به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-14- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده HSP۷۰ Family Members به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-15- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده HSP۴۰ Family Members به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-16- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده HSP۶۰ Family Members به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-17- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده Small HSPs به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 3-18- مشخصات و میزان بیان ژن‌های خانواده Other Regulators of Protein Folding به دنبال مهار واریانت OCT۴B۱ در سه رده سلولی مورد مطالعه

جدول 4-1- ژن‌های کنترل‌کننده مسیر آپوپتوزیس که پس از مهار واریانت OCT۴B۱ کاهش بیان (Down-regulation) بیش از دو برابر (>۲ folds) داشته‌اند.

جدول 4-2- ژن‌های کنترل‌کننده مسیر آپوپتوزیس که پس از مهار واریانت OCT۴B۱ افزایش بیان (Up-regulation) بیش از دو برابر (>۲ folds) داشته‌اند.

جدول 4-3- ژن‌های کنترل‌کننده مسیر استرس که پس از مهار واریانت OCT۴B۱ کاهش بیان (Down-regulation) بیش از دو برابر (>۲ folds) داشته‌اند.

جدول 4-4- ژن‌های کنترل‌کننده مسیر استرس که پس از مهار واریانت OCT۴B۱ افزایش بیان (Up-regulation) بیش از دو برابر (>۲ folds) داشته‌اند.

فهرست تصاویر و جداول پیوست:

پیوست ۱- درخت ژنی تغییرات بیان ۸۴ ژن مسیر آپوپتوزیس در رده‌های سلولی مورد مطالعه

پیوست ۲- بیان افتراقی ژن‌های مسیر آپوپتوزیس در رده‌های سلولی مورد مطالعه

پیوست ۳- درخت ژنی تغییرات بیان ۸۴ ژن مسیر استرس سلولی در رده‌های سلولی مورد مطالعه

پیوست ۴- بیان افتراقی ژن‌های مسیر استرس سلولی (پروتئین‌های شوک حرارتی و چاپرون ها) در رده‌های سلولی مورد مطالعه

چکیده

سرطان یکی از بیماری‌های مهم انسان است که در خصوص ماهیت ایجاد و گسترش آن و در نتیجه در خصوص درمان آن نیز اطلاعات کاملی وجود ندارد؛ بنابراین شناخت مکانیسم‌های شکل‌گیری سلول سرطانی بسیار حائز اهمیت است.

در خصوص ایجاد سرطان در بافت‌های بدن انسان نظریات مختلفی مطرح است اما تئوری سلول بنیادی سرطان (Cancer stem cell)، جدیدترین و بااهمیت‌ترین این نظریات است. طبق این نظریه، منشأ سرطان در بدن سلول‌هایی هستند که قدرت بنیادی (Stem cell) دارند این سلول‌ها می‌توانند سلول‌های بنیادی بافتی باشند یا سلول‌های سوماتیکی که به علت تغییرات ژنتیکی خاصیت خودبازآفرینی (Self-renewal) پیدا کره‌اند.

بر این اساس، ژن‌هایی که القاء کننده قدرت نامیرایی هستند مورد توجه قرار گرفتند که یکی از مهم‌ترین این ژن‌ها، OCT۴ است.

این ژن با فرایند پردازش افتراقی (Alternative splicing) حداقل سه واریانت مختلف را کد می‌کند (OCT۴A، OCT۴B و OCT۴B۱). اخیراً مشخص شده است واریانت OCT۴B۱ در سلول‌های سرطانی نسبت به دیگر واریانت های OCT۴ بیان بالاتری داشته و قدرت سرکوبگری مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول (آپوپتوزیس) دارد؛ همچنین نشان داده شده است این واریانت به دنبال اعمال استرس سلولی (شوک حرارتی)، به همراه پروتئین‌های شوک حرارتی افزایش بیان پیدا می‌کند.